鼠尾胶原联合血小板源性生长因子BB培养内皮细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.006

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (8): 1177-1183.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.006

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鼠尾胶原联合血小板源性生长因子BB培养内皮细胞

曹雯，赵爱超，陈邦党，刘芬，马依彤，马翔

新疆医科大学第一附属医院冠心病二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-12-09 出版日期:2015-02-19 发布日期:2015-02-19
通讯作者: 马翔，博士，主任医师，副教授，硕士、博士生导师，新疆医科大学第一附属医院冠心病二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:曹雯，女，1988年生，江苏省宜兴市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事冠状动脉粥样硬化性心脏病基础及临床方面的研究。
基金资助:
国家青年科学基金(81000089)

Combination of rat tail collagen and platelet-derived growth factor-BB for culture of human umbilical vein endothelial cells

Cao Wen, Zhao Ai-chao, Chen Bang-dang, Liu Fen, Ma Yi-tong, Ma Xiang

Second Department of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-12-09 Online:2015-02-19 Published:2015-02-19
Contact: Ma Xiang, M.D., Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Second Department of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Cao Wen, Studying for master’s degree, Second Department of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81000089

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究证实，Ⅰ型鼠尾胶原可促进成肌纤维细胞的增加，对内皮细胞的迁移及成管有较为明显的作用，推断胶原可为细胞的生长提供一个较为合适的内环境。

目的：探讨鼠尾胶原联合血小板源性生长因子BB抗人脐静脉内皮细胞凋亡的效果及安全性。

方法：将第4代人脐静脉内皮细胞培养于铺有鼠尾胶原的培养皿上，用Alamar Blue法检测不同时间点的还原比率。将第4代人脐静脉内皮细胞分为4组培养于24孔板，其中生长因子组是在细胞接种前加入血小板源性生长因子BB蛋白于细胞悬浮液中；联合组需事先加入血小板源性生长因子BB蛋白于鼠尾胶中，铺于板底；最后各组均使用H₂O₂诱导凋亡，73 h后采用Western blot 测定血小板源性生长因子BB、凋亡相关蛋白及抗凋亡蛋白的表达，同时Tunnel检测细胞凋亡阳性率。

结果与结论：在铺有鼠尾胶原培养皿中培养人脐静脉内皮细胞的成管数量明显多于正常培养人脐静脉内皮细胞的成管数量(P < 0.05)。鼠尾胶原培养的细胞与正常对照细胞生长状态相似，说明鼠尾胶原对细胞无明显毒性作用。联合组血小板源性生长因子BB、Bcl-2、p-Akt表达高于其余3组(P < 0.05)，Bax表达低于其余3组(P < 0.05)。联合组细胞凋亡率低于生长因子组、H₂O₂组(P < 0.05)。表明鼠尾胶原对人脐静脉内皮细胞无明显毒性作用，联合血小板源性生长因子BB生长因子后可显著增强抗细胞凋亡效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 人脐静脉内皮细胞, 鼠尾胶原, 血小板源性生长因子BB, 抗凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Rat tail collagen type I can promote the increase of muscle fiber cells and migration and tube formation of endothelial cells, which is speculated to provide a more suitable internal environment for the growth of cells.

OBJECTIVE: To observe the effect and safety of platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) with rat rail collagen against apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in vitro.

METHODS: The passage 4 human umbilical vein endothelial cells were cultured in the medium of rat rail collagen and the reduction ratio in different time points was detected by Alamar Blue. The passage 4 human umbilical vein endothelial cells were divided into four groups and cultured in 24-well culture plates: control group, PDGF-BB group, H₂O₂ group, PDGF-BB+collagen group. H₂O₂ was used to induce cell apoptosis in all the groups. Western blot was used to detect the expression of PDGF-BB, apoptosis-related protein and anti-apoptosis protein after 72 hours. Meanwhile, TUNEL method was used to detect cell apoptotic rate.

RESULTS AND CONCLUSION: The tube formation in the human umbilical vein endothelial cells was more than that cultured in normal medium (P < 0.05). Cells cultured with rat tail collagen showed similar growth to normal control cells, indicating rat tail collagen had no cytotoxicity. The expressions of PDGF-BB, Bcl-2, and p-Akt in the PDGF-BB+collagen group were significantly higher than those in the other three groups (P < 0.05), but the expression of Bax was lower than that in the other three groups (P < 0.05). The apoptotic rate in the PDGF-BB+collagen group was lower than the PDGF-BB group and H2O2 group (P < 0.05). These findings indicate that rat tail collagen has no cytotoxicity to human umbilical vein endothelial cells, and rat tail collagen combined with PDGF-BB can predominantly enhance anti-apoptosis effects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Endothelial Cells, Collagen, Platelet-Derived Growth Factor

中图分类号:

R318

曹雯，赵爱超，陈邦党，刘芬，马依彤，马翔. 鼠尾胶原联合血小板源性生长因子BB培养内皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1177-1183.

Cao Wen, Zhao Ai-chao, Chen Bang-dang, Liu Fen, Ma Yi-tong, Ma Xiang. Combination of rat tail collagen and platelet-derived growth factor-BB for culture of human umbilical vein endothelial cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1177-1183.

图/表（结果） 2

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引言

心血管疾病严重威胁着人类的健康，其中心肌梗死是造成死亡的主要原因之一^[1]。现今首选的治疗方法是恢复梗死区血供，同时进一步促进心肌细胞的再生。细胞基质为细胞提供稳定的微环境，而胶原作为一种广泛存在的细胞基质，在细胞之间起到了传递氧气、营养、代谢废物及重要信号或者内分泌因子的作用^[2]。

随着生物工程的发展，细胞外基质已被广泛应用于组织工程领域中，所谓细胞外基质，实际上是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构，调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质涵盖了很多生物材料，包括胶原纤维、纤维蛋白胶、藻酸盐、透明质酸等^[3-4]。根据既往研究目前已有28种胶原的类型被发现，这些胶原纤维组成了疏松或者是坚硬的胶原结缔组织，而事实上Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及V型胶原纤维是作为组成骨骼、软骨、肌腱、皮肤及肌肉最常见的成分。胶原纤维是一种使用频率较高的生物材料，究其原因与胶原纤维可以作为一种3D结构包绕在各种细胞周围，促进了细胞与细胞之间的物质运输，以及改善了细胞所在内环境方面密不可分。胶原纤维在组织工程、整容手术及药物传递系统得到了广泛应用，Awad等^[5-7]应用Ⅰ型胶原在不同的环境当中培养了兔跟腱细胞，使用胶原纤维海绵与骨髓来源的间充质干细胞融合后注射入机体内，发现与周围组织的融合率达到3/4^[6]。在心血管研究方面，将胶原Ⅰ和Ⅲ混合后注入梗死心肌，发现心脏的每搏输出量与对照组相比有明显差别，但心室重构并不明显，这是因为注入梗死心肌的胶原纤维充当“微支架”的作用，增加了瘢痕的厚度，减弱了瘢痕的挛缩，从而进一步抑制了心室重构^[4]，同时发现在梗死区域内有新生的微血管。近期研究将胶原蛋白Ⅰ联合高分子复合物制成三维支架，以补片的形式附着于梗死心肌表面，胶原纤维促进了心肌细胞的再生及细胞的迁徙^[8]。在本实验中，选择的鼠尾胶原属于Ⅰ型胶原，其取材较为方便，可塑性较强，有利于细胞的贴壁^[2]；胶原纤维中含有多种氨基酸，如甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸等，为细胞的生长提供了良好的微环境；另外胶原纤维具有较为良好的生物降解性，随着时间的推移，可在体内完全降解，减少了体内对异物的排异反应。

血小板生长因子是一个具有多种生物学活性的蛋白质家族，包括血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子CC和血小板源性生长因子DD。血小板源性生长因子BB是一种广泛存在的既可以促进血管新生又具有抗凋亡等功能的因子^[9-10]，该因子可以通过激活多种不同信号通路^[11]，促进细胞的增殖、迁移及存活。本实验以体外培养的人脐静脉内皮细胞为模型，探讨鼠尾胶原对人脐静脉内皮细胞成管性和安全性的作用，以及联合血小板源性生长因子BB是否可增强抗人脐静脉内皮细胞凋亡的效果，为胶原联合血小板源性生长因子BB移植入体内提供充足的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察细胞实验。

时间及地点：实验于2013年1至8月在新疆医科大学第一附属医院冠心病实验室完成。

材料：人脐静脉内皮细胞株HUVEC购买于上海细胞库。

实验动物：清洁级SD大鼠15只，雌雄不拘，体质量200-250 g，饲养环境良好，购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(新) 20140-0003。

实验方法：

细胞培养：将人脐静脉内皮细胞按密度1.0×10⁵-1.5×10⁵/cm² 接种于6孔板，以含体积分数20%胎牛血清的M199培养基培养，置于体积分数5%CO₂饱和湿度、37 ℃培养箱中培养，每3 d更换生长液1次，待细胞融合达80%-90%可进行细胞传代。

鼠尾胶原的制备^[12]：所有操作都需在无菌条件下进行，双蒸水配置0.1%醋酸。获取SD大鼠尾巴，蒸馏水洗净，体积分数75%乙醇浸泡30 min，去皮、抽出银色尾键，将大鼠尾键剪碎后，置无菌三角烧瓶中称重，每克尾键加50 mL 0.1%醋酸。将称量后的尾键放于50 mL无菌离心管中，加入0.1%醋酸溶液，封口膜封口，4 ℃ 48 h不停振荡，4 ℃、4 000 r/min 离心30 min后，取上清，如上清液仍不清澈，可继续以4 000 r/min离心，直至上清液清澈，即为鼠尾胶原。

鼠尾胶原培养细胞：将24孔板中的12个孔作为对照，余下的每孔中均匀铺250 µL鼠尾胶原，将铺好的鼠尾胶原放置于37 ℃培养箱中30 min后取出，吸出剩余胶原液，用M199冲洗二三遍后等待备用。将第3代人脐静脉内皮细胞饥饿处理8 h，消化并悬浮于培养液中。在处理过的 24孔板上，接种第4代细胞人脐静脉内皮悬浮细胞，接种密度为1×10⁴/cm²，将其放于37 ℃培养箱中，待细胞贴壁72 h后在光学显微镜下观察成管情况并拍照。

采用Alamar Blue法评估鼠尾胶原细胞毒性：将第4代人脐静脉内皮分别接种于铺满含有鼠尾胶的24孔板及空24孔板中，每孔中细胞密度为1×10⁴/cm²，两板均加入Alamar Blue，使其最终浓度为10%，在培养的12，24，36，48，60，72 h，用酶标仪测定570 nm和600 nm的吸光度A值，每组需要3个副孔。

还原比率A=(117 216×实验组A₅₇₀-80 586×实验组A₆₀₀)/(117 216×正常对照组A₅₇₀-80 586×正常对照组A₆₀₀) ×100%。

血小板源性生长因子BB处理及诱导细胞凋亡：当细胞融合达到80%-90%时进行传代，使用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×10⁴/cm²接种到24孔板。分组培养：对照组，与培养基混合后直接接种，培养72 h后，使用500 μmol/L H₂O₂反应1 h诱导细胞凋亡；双氧水组，细胞培养72 h后，使用500 μmol/L H₂O₂反应1 h诱导细胞凋亡；生长因子组，在细胞接种前加血小板源性生长因子BB蛋白于细胞悬浮液中，一同接种于24孔板上，保证血小板源性生长因子BB蛋白至终浓度为20 μmol/L，蛋白处理72 h后，使用 500 μmol/L H₂O₂反应1 h诱导细胞凋亡^[13]；联合组，需事先加血小板源性生长因子BB蛋白于鼠尾胶中，铺于板底，保证添加血小板源性生长因子BB蛋白至终浓度为 20 μmol/L，蛋白处理72 h后，使用500 μmol/L H₂O₂反应 1 h诱导细胞凋亡^[13]。

主要观察指标：

总蛋白提取及Western检测：各组细胞培养73 h后，使用常规方法提取总蛋白，随后按照BCA蛋白定量法定量所有蛋白，蛋白上样量为40 µg，12%SDS-PAGE电泳，约2.5 h，湿法将蛋白转移至0.22 µm的PVDF膜，转膜时间约2 h，1%BSA封闭2 h，添加一抗PDGF-BB、Bcl-2、Bax、P-Akt、Akt 抗体(分别按照合适的比例稀释抗体)，于4 ℃摇床孵育过夜后，TBST液洗膜3次，加相应二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，采用AP显色法显色。

Tunel法检测细胞凋亡情况：细胞凋亡试剂盒购自德国罗氏公司。细胞培养73 h后，将细胞以0.1%PBS洗3遍后，使用40 g/L多聚甲醛固定30-60 min，再次使用PBS清洗3遍，加入含有0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min，PBS再次清洗2次，按照一定比例配制Tunel检测液，每个孔加入50 µL，37 ℃避光孵育60 min，PBS再次清洗3遍，用抗荧光淬灭封片液封固后，荧光显微镜下观察阳性细胞数，使用激发波长范围为450-500 nm，发射波长范围为515-565 nm。

血管数量统计：首先定义“节点”和“终点”，节点就是在血管中心线上两条线教会(或者分开的点)；终点就是血管中心线上沿血管方向的最后一个点。节点与节点之间或者节点与终点之间被看作是一段血管。血管分支的数量通过血管分支数和血管节点数这两个指标来反映。通过该种方法统计不同组中血管的数量。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，组间比较采用多因素方差分析，计量资料可采用x(_)±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

细胞外基质既可以作为细胞与细胞之间相互连接的媒介，同时又可以为细胞生存提供一个稳定且富有营养的内环境^[14]，随着医学的发展，这种材料可为细胞提供一个类似于细胞外基质的生存环境，因此生物材料成为目前研究的热点。大量研究已证实，理想的生物材料应该具有可降解性、生物力学性及可塑性^[15]，这些特性可以为细胞提供一个较为良好的生存环境。本实验中提到的胶原是一种较为常用的生物材料，其功能与特性与细胞外基质类似，另外胶原是一种具有3股螺旋结构的物质，这3股链均为α链，每一条α链里又含有成千上万的氨基酸，其中羟脯氨酸含量较高，胶原结构及其本身的特性恰好有利于细胞的生长。据相关研究报道，自然界中的胶原有28种之多。

鼠尾胶原来自于鼠尾的尾键，属于Ⅰ型胶原，可以作为一种天然的培养基，促进体外培养的细胞(特别是上皮细胞)贴壁，同时具有组织相容性好且对生物体免疫原性低等优点。Huang等^[16]在研究中证实，Ⅰ型鼠尾胶原可促进成肌纤维细胞的增加，对内皮细胞的迁移及成管有较为明显的促进作用^[17-21]，推断这可能跟胶原可为细胞生长提供一个较为合适的内环境，以及其较为致密的结构有关。本实验发现鼠尾胶原在体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC 5-7 d后就可以促进内皮细胞成管，这与先前的体内研究相符合。本实验与其他研究相比的创新点在于使用自制鼠尾胶原培养细胞，通过Alamar Blue法检测鼠尾胶原对细胞的毒性作用，如果保证鼠尾胶原的制备是在无菌条件下进行，那么其对细胞生长并无其他的毒害作用。

血小板源性生长因子BB是一种肽类生长因子，属于分泌性蛋白，具有剂量与时间相依赖性，它主要由单核/巨噬细胞分泌，以α颗粒形式储存于血小板中，既具有促增殖作用又具有抗凋亡的作用。但与成纤维细胞生长因子2、转化生长因子α、胰岛素样生长因子等生长因子的促增殖相比，血小板源性生长因子较为明显的是其对细胞的抗凋亡作用^[20]。

Src、PI3K、SHP-2和PLC-γ等途径是现已证实调节凋亡/抗凋亡的经典途径，而血小板衍生生长因子BB抗凋亡的调节主要是通过PI3K/Akt途径。其中PI3K属于一个蛋白家族，根据其不同的特性可分3类，现研究较为广泛的为Ⅰ类，即许多生长因子(如成纤维生长因子、血管内皮生长因子、血小板生长因子等)可以激活PI3K途径，PI3K激活后在质膜上产生第二信使PIP3，之后PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖激酶1结合，促进Akt的活化，活化后的Akt通过下游的多种途径对靶蛋白进行磷酸化修饰，从而发挥其抗凋亡效果^[21]，另外Akt还可以激活IKB激酶(IKKα)，导致核因子kB的抑制剂IkB降解，使核因子kB从细胞质中释放出来进行核转位。Bcl-2及其家族中相关成员发生磷酸化作用，激活靶基因抑制细胞凋亡，促进细胞的存活。

本实验中p-Akt及Bcl-2蛋白表达水平的上调与细胞信号传导通路相一致，而促凋亡蛋白Bax表达的下调证明细胞凋亡被抑制，这与Marius等^[22]研究结果相似。血小板衍生生长因子BB作为一种治疗心血管疾病的生长因子，其最大的优点是可以抗凋亡，同时又不促进成纤维细胞的增殖，对于缺血性心脏并来说有效抑制了心室壁的重塑及心室肥大。

既往治疗心血管疾病的研究大多数将目光放在体内研究上，通过不同方法直接将细胞或者生长因子移植到病变区域，但治疗效果欠佳。2005年，Dai等^[23]首次将胶原注射入梗死心肌内，6周后发现射血分数及每搏输出量均高于对照组，同时左室壁厚度及梗死面积均小于对照组，从此将胶原作为一种生物材料成为研究的重点。以往细胞或者生长因子移植后局部区域细胞存活率较低，或者大量生长因子流失，将胶原作为载体后，细胞或因子黏附在梗死区域，在限制细胞或者生长因子流失的同时又为局部心肌提供了较为优越的内环境^[24]。正如Ozawa等^[25]研究发现，只有当微环境中血管内皮生长因子达到一定浓度才可以发挥其作用。

本实验证明与仅使用血小板源性生长因子BB相比，血小板源性生长因子BB与鼠尾胶原联合后，可促进人脐静脉内皮细胞HUVCE长期有效表达血小板源性生长因子BB，并能够明显减少细胞凋亡数量，这可能与胶原本身可为细胞生长提供良好的微环境，同时血小板源性生长因子BB为一种分泌型蛋白，与胶原混合后减少了血小板源性生长因子BB的丢失，维持了局部血小板衍生生长因子BB的浓度有关。生物材料的存在显著减少了生长因子的丢失，无论对细胞增殖或者抑制凋亡均有较为普遍的意义。虽然血小板源性生长因子BB与鼠尾胶原联合后是如何延长抗凋亡的机制并不清楚，初步考虑可能与鼠尾胶原作为血小板源性生长因子BB的储存库为细胞不断提供血小板源性生长因子BB有关。本实验证实了血小板源性生长因子BB联合鼠尾胶原后能更长效表达，同时发挥抗凋亡作用更持久、更有效。

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